Biosynthesis scale-up of human soluble catechol-O-methyltransferase

Catechol-O-methyltransferase (COMT, EC 2.1.1.6) was first described in 1958. It is a Sadenosyl-L-methionine (SAM) dependent methyltransferase which catalyses the methylation of catechol substrates (catecholamines, catecholestrogens). This enzyme has several important functions in the body, acting as a barrier between the blood and various organs, through the elimination of toxic or biologically active catechols. COMT plays a particularly important role in the brain, where it participates in the metabolism of the neurotransmitter dopamine, and so its role in neurodegenerative diseases is extremely relevant, especially in Parkinson's disease. In recent years, several COMT inhibitors have been developed for Parkinson's disease treatment, and there is considerable interest in developing new and more effective inhibitors. To do so, large amounts of COMT in an active form are necessary, and the best way to achieve this is by up-scaling its production through biotechnological processes. In this work, we propose a fed-batch process for biosynthesis scale-up of the soluble isoform of COMT, using an Escherichia coli expression system for the production of the soluble isoform of this protein, testing various fermentation conditions and controlling various parameters during the process. After several different batch and fed-batch experiments, the selected fermentation conditions were 20% dissolved oxygen, an initial batch concentration of 20 g/L of glycerol and tryptone, and a constant feed of 1 g glycerol/L/h, achieving a final specific COMT activity of 442.34 nmol/h/mg. Cell viability was monitored by flow cytometry and glycerol concentration by an HPLC system.A proteína catecol-O-metiltransferase (COMT, CE 2.1.1.6) foi descrita pela primeira vez em 1958. É uma enzima metiltransferase dependente da S-adenosil-L-metionina (SAM) que catalisa a metilação de substratos catecólicos (catecolaminas, catecolestrogénios). Esta enzima desempenha várias funções importantes no organismo, funcionando como uma barreira entre o sangue e diversos orgãos, através da eliminação de catecóis biológicamente activos ou tóxicos. A enzima COMT desempenha ainda uma função particularmente importante no cérebro, onde participa no metabolismo do neurotransmissor dopamina, pelo que o seu papel nas doenças neurodegenerativas é extremamente relevante, nomeadamente na doença de Parkinson. Esta deonça é caracterizada pela perda progressive de neurónios libertadores de dopamina, levando a uma diminuição acentuada dos níveis deste neurotransmissor no cérebro. Nesta patologia, um dos principais alvos terapêuticos é a enzima COMT, já que a sua ação é indesejável nos pacientes portadores desta doença. Nos últimos anos têm vindo a ser desenvolvidos vários inibidores desta enzima para o tratamento da doença de Parkinson, e há um grande interesse em desenvolver novos inibidores mais eficazes. Para tal, são necessárias grandes quantidades de COMT numa forma activa, e a melhor maneira de o conseguir é a sua produção em larga escala através de processos biotecnológicos. Neste trabalho é proposto um processo de produção em larga escala da isoforma solúvel da COMT, utilizando o sistema de expressão Escherichia coli para a biosíntese da isoforma solúvel desta proteína e testando várias condições de fermentação, com o objectivo de estabelecer um processo de fermentação descontínuo com posterior fornecimento de substrato, controlando vários parâmetros durante esta fase. As condições de fermentação escolhidas, após terem sido testadas em processos de fermentação contínuos, foram uma percentagem de oxigénio dissolvido de 20%, uma concentração de 20 g/L das fontes de carbono e azoto (glicerol e triptona, respectivamente), e por fim, um perfil de adição de substrato no processo de alimentação de 1 g glicerol/L/h. Os resultados finais foram uma densidade óptica máxima de aproximadamente 50 e uma actividade enzimática especifica de 442.34 nmol/h/mg